Simone
①Ti质粒的来源大多数以植物作为宿主有机体的克隆载体都以Ti质粒为基础，Ti产生于一种称为根癌农杆菌的土壤细菌。②Ti质粒的特点根癌农杆菌侵入植物组织后，可导致冠瘿的癌性生长。在根癌农杆菌的感染过程中，Ti内称为T-DNA的部分整合到植物染色体DNA中。③Ti质粒的应用以Ti质粒为基础的克隆载体，利用T-DNA的整合能力，携带有用基因进入植物基因组中，这些基因可使植物具有抗病等有利特征。再给你一段文章的检索是关于Ti质粒的（1） Ti 质粒的结构与功能Ti 质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为双链共价闭合的环状DNA分子。Ti 质粒大约在160～240kB之间。其中T-DNA大约在15kb-30kb。根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱种类坦神，Ti 质粒可分为4 类：章鱼碱型(octopine)、胭脂团斗碱型(nopaline)、农杆碱型(agropine)和农杆菌素碱型(agrocinopine)。Ti 质粒可分为4 个功能区域：①T-DNA区(transferred-DNA region)：T-DNA是根癌农杆菌侵染植物细胞时从Ti 质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA；②Vir 区(virulence region)：Vir 区上的基因能激活T-DNA 转移，使根癌农杆菌表现出毒性；③Con 区(regions encoding conjugations，接合转移编码区)：该区段上存在与细菌间接合转移的有关基因，调控Ti 质粒在农杆菌之间的转移；④Ori区(origin of replication，复制起始区)：Ori区上的基因调控Ti 质粒的自我复制。T-DNA上共含有tms、tmr和tmt 3 套基因。其中tms和tmr 2 套基因分别控制合成植物生长素与分裂素，促使植物创伤组织无限制地生长与分裂，形成冠瘿瘤。tms基因组由iaaH和iaaM 2 个基因组成，控制由色氨酸产生生长素吲哚乙酸的生物合成途径；tmr 基因组中的iptZ 负责由异戊烯焦磷酸和AMP 合成分裂素的反应；tmt 基因组的编码产物可催化合成冠瘿碱(Opines)。冠瘿碱的代谢产物为氨基酸和糖类，是根癌农杆菌生长必需的物质，供根癌农杆菌作为营养使用。此外，在T-DNA 的两端还含有左右2 个边界，左边界(left border, LB)和左边界(right border, RB)是长为25bp的末端重复顺序，在切除及整合过程具有重要意义。（2）Ti 质粒的转化机理根癌农杆根瘤菌之所以会感染植物根部是因为植物根部损伤部位会分泌出酚类物质乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮，这些酚类物质能诱导Ti 质粒上的vir基因以及根癌农杆菌染色体上的一个操纵子表达。vir 基因产物将Ti 质粒上的T-DNA 单链切下，而根癌农杆菌染色体上的操纵子表达产物则与单链T-DNA 结合形成复合物，转化植物根部细胞。整个过程大致可分为以下几个步骤：①根癌农杆菌对植物细胞的识别和附着；②根癌农杆菌对植物信号物质的感受；③根癌农杆菌Ti 质粒上的vir 基因以及染色体上操纵子的活化；④T-DNA 复合体的产生；⑤T-DNA复合体的转运；⑥T-DNA整合到植物基因组中。（3）野生型Ti 质粒的改造和中间载体的构建Ti 质粒是植物基因工程的一种天然载体。但野生型Ti 质粒不能直接用作克隆外源基因的载体。这主要表现在：①野生型Ti 质粒分子过大，因而在基因工程中操作起来十分麻烦；②野生型Ti 质粒上分布着各种限制型核酸内切酶的多个酶切位点，不论用何种限制型核酸内切酶切割，都会切成很大片段。而且即使在T-DNA 上也很难找到可利用的单一的酶切位点；③T-DNA上的tms和tmr 基因产物将干扰受体植物内源激素的平衡，导致冠瘿瘤的产生，阻碍转基因植物细胞的分化和植株的再生；④冠瘿碱的合成过程消耗大量的精氨酸和谷氨酸，直接影响转基因植物细胞的塌信磨生长代谢；⑤野生型Ti 质粒没有大肠杆菌(Escherichia coli)的复制起点和作为转化载体的选择标记基因。因此，必须对野生型的Ti 质粒进行改造后才能作为转基因植物的载体。对野生型Ti 质粒的改造，主要包括以下几个方面：①删除T-DNA上的tms、tmr和tmt基因；②加入大肠杆菌复制起点和选择标记基因，构建根癌农杆根瘤菌-大肠杆菌穿梭质粒，便于重组分子的克隆与扩增；③引入植物细胞的筛选标记基因，如细菌来源的新霉素磷酸转移酶II基因(neomycin phosphotransferase II, NPT II)等，便于转基因植物细胞的筛选；④引入植物基因的启动子和polyA化信号序列；⑤插入人工多克隆位点，以利于外源基因的克隆。⑥除去Ti 质粒上的其它非必需序列，最大限度地缩短载体的长度。由于大肠杆菌具有能与根癌农杆菌高效接合转移的特征。因此，为了使Ti 质粒成为有效的外源基因导入载体，科学家们将T-DNA片段克隆进大肠杆菌的质粒，并插入目的基因，而后通过接合转移将目的基因引入到根癌农杆菌的Ti 质粒。带有重组T-DNA的大肠杆菌衍生载体称为中间载体(intermediate vector)，而接受中间载体的Ti 质粒则称为受体Ti 质粒(acceptor Ti plasmid)。构建中间载体是解决Ti 质粒不能直接导入目的基因的有效方法之一。中间载体是一种在一个普通大肠杆菌的克隆载体(如pBR322 质粒)中插入了一段合适的T-DNA片段而构成的小型质粒。（4）中间载体的表达构建在中间载体中加上能在植物细胞中表达的各种启动子，可使外源基因在植物细胞中表达；当启动子与显性选择标记基因及报告基因连接，构成嵌合基因(chimeric gene)时，这些标记基因同样能表达，从而可提供用于筛选和鉴定的表型。这类含植物启动子的中间载体称为中间表达载体(intermediate expression vector)。目前已从动物、植物、病毒及微生物中分离到许多适用于植物的启动子。根据作用方式及功能可将启动子分为3 类：组成型启动子、诱导型启动子和组织特异型启动子。①组成型启动子(constitutive promoter)是指在该类启动子控制下，结构基因的表达大体恒定在一定水平上，在不同组织、部位表达水平没有明显差异。目前使用最广泛的组成型启动子是花椰菜花叶病毒(CaMV)35S 启动子、来自根癌农杆菌Ti 质粒T-DNA 区域的胭脂碱合成酶基因Ocs 启动子，后者虽来自细菌，但具有植物启动子的特性。②组织特异启动子(tissue-specific promoter)又称器官特异性启动子。在这类启动子调控下，基因往往只在某些特定的器官或组织部位表达，并表现出发育调节的特性。例如烟草的花粉绒毡层细胞中特异表达基因启动子TA29，豌豆的豆清蛋白(leguimin)基因启动子可在转化植物种子中特异性表达，马铃薯块茎储藏蛋白(patatin)基因启动子在块茎中优势表达。③诱导型启动子(inducible promoter)是指在某些特定的物理或化学信号的刺激下，该种类型的启动子可以大幅度地提高基因的转录水平。目前已经分离了光诱导表达基因启动子、热诱导表达基因启动子、创伤诱导表达基因启动子、真菌诱导表达基因启动子和共生细菌诱导表达基因启动子等。目前植物基因工程中常采用的终止子是胭脂碱合成酶的nos终止子和Rubisco小亚基基因的3′端区域。（5）植物表达载体的构建中间表达载体是不能将外源基因转化进植物细胞。因此，必须将中间表达载体引入到上述已改造的受体Ti 质粒中，并构建成能侵染植物细胞的基因转化载体(它是由两种以上质粒构成的复合型载体，故称之为载体系统)，才能在植物基因转化中应用。为利用根癌农杆菌的Ti 质粒，发展了一元载体系统和双元载体系统。一元载体系统是指首先将目的基因插入到中间表达载体上，筛选出含有目的基因的重组分子，然后将重组质粒转化到根癌农杆菌中，重组质粒与Ti 质粒上的同源序列发生同源重组，将外源基因整合到Ti 质粒上，用于侵染植物细胞。T-DNA 重组分子就可整合到植物细胞染色体DNA 上。最后利用植物选择标记基因筛选转化细胞。简单而言，一元载体系统就是指含有目的基因的中间表达载体与改造后的受体Ti 质粒通过同源重组所产生的一种复合型载体，通常又称为共整合载体(co-integrated vector)；由于该载体的T-DNA区与Ti 质粒Vir 区连锁，因而又称为顺式载体(cis-vector)。双元载体(binary vector)系统是指由两个分别含T-DNA和Vir区的相容性突变Ti质粒构成的系统。其中之一是含有T-DNA转移所必需的Vir 区段质粒，它缺失或部分缺失T-DNA序列。它的主要作用是表达毒蛋白，激活T-DNA 的转移，故称为辅助Ti 质粒(helper Ti plasmid)；另一个则是含有T-DNA的质粒。一般作为目的基因的载体，由于其分子量较小，故称为微型质粒(mini-Ti plasmid)。它是一种寄主范围广泛的DNA转移载体质粒。它既含有大肠杆菌复制起始位点，又含有根癌农杆菌复制起始位点，实际上是一种大肠杆菌-农杆菌穿梭质粒。这两种质粒在单独存在的情况下，均不能诱导植物产生冠瘿瘤。若根癌农杆菌细胞内同时存在这两种质粒时，便可获得正常诱导肿瘤的能力。因此，含有双元载体的根癌农杆菌细胞浸染植物时，就可以将含有目的基因的T-DNA整合进植物基因组中。目前以T-DNA转化植物细胞的标准方法大多采用Ti 质粒介导的双元载体系统。首先将目的基因插入到微型质粒，含有目的基因的重组微型质粒转化大肠杆菌后，再导入携带辅助Ti 质粒的根癌农杆菌中，经筛选后直接感染植物细胞。根癌农杆菌侵染植物细胞后，植物的创伤信号启动Ti 质粒上的vir基因，随后将微型质粒上的T-DNA切割下来，转移到植物细胞中。由于双元载体系统的T-DNA和Vir 区在两个独立的质粒上，通过反式激活T-DNA转移，故又称为反式载体(trans-vector)。（6）Ti 质粒介导的转移转化方法目前已建立了多种根癌农杆菌Ti 质粒介导的植物基因转化方法，其基本程序包括：含重组Ti 质粒的根癌农杆菌的培养，选择合适的外植体，根癌农杆菌与外植体共培养，外植体脱毒及筛选培养，转化植株再生等步骤。叶盘转化法：叶盘转化法(leaf dish transformation)是Monsanto公司Morsch等人(1985)建立起来的一种转化方法。其操作步骤为：首先用打孔器从消毒叶片上取下直径为2～5mm 圆形叶片，即叶盘。再将叶盘放入培养至对数生长期的根癌农杆菌液浸泡几秒钟，使根癌农杆菌浸染叶盘。然后用滤纸吸干叶盘上多余的菌液，将这种经浸染处理过的叶盘置于培养基上共培养2～3d，再转移到含有头孢霉素或羧苄青霉素抑菌剂的培养基中，除去根癌农杆菌。与此同时在该培养基中加入抗生素进行转化体的筛选，使转化细胞再生为植株。对这些再生植物进行分子检测就可确定它们是否整合有目的基因及其表达情况。叶盘转化法已在多种双子叶植物上得到成功的应用。实际上，其他的多种外植体，例如茎段、叶柄、胚轴、子叶愈伤组织、萌发的种子均可采用类似的方法进行转化。该方法的优点是适用性广且操作简单，是目前应用最多的方法之一。原生质体共培养转化法：原生质体共培养转化法是以原生质体作为受体细胞，通过将根癌农杆菌与原生质体作短暂的共培养，然后洗涤除去残留的根癌农杆菌后，置于含抗生素的选择培养基上筛选出转化细胞，进而再生成植株。与叶盘转化法相比，此法得到的转化体不含嵌合体，一次可以处理多个细胞，得到相对较多的转化体。应用此法进行基因转化时，其先决条件就是要建立起良好的原生质培养和再生植物技术体系。整株感染法：此法是模仿根癌农杆菌天然的感染过程，用根癌农杆菌直接感染植物而进行遗传转化的一种简单易行的方法。其做法是：人为地在植株上造成创伤，然后把含有重组质粒的根癌农杆菌接种在创伤面上，或把含有重组质粒的根癌农杆菌注射到植物体内。使根癌农杆菌在植物体内进行浸染实现转化。为了获得较高的转化频率，一般多采用无菌种子的实生苗或试管苗。用去除了致瘤基因的根癌农杆菌进行整株感染后，受伤部位一般不会出现肿瘤。在筛选转化体时，可将感染部位的薄壁组织切下放入选择培养基上及诱发愈伤组织的培养基上进行筛选和愈伤组织诱导。最后将转化的愈伤组织转移至含合适植物激素的培养基上诱导再生植株。在拟南芥(Arabidopsis thaliana)上，将根癌农杆菌涂于植株腋芽处或顶牙，可长出转化的新枝条，新的转化枝条开花结实后，也可以获得转基因种子；或者通过真空渗透或农杆菌浸泡拟南芥开花植株，等结实之后，利用筛选萌芽种子的方法，也可以得到转基因植株及种子。2 发根农杆菌介导转化法发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)是与根癌农杆菌同属的一种病原土壤杆菌。但与根癌农杆菌不同的是，发根农杆菌从植物伤口入侵后，不能诱发植物产生冠瘿瘤，而是诱发植物产生许多不定根。这些不定根生长迅速，不断分枝成毛状，故称之为毛状根或发状根(hairy root)。发状根的形成是由存在于发根农杆菌中的Ri质粒(root inducing plasmid,根诱导质粒)所决定的。Ri 质粒是发根农杆菌染色体外的遗传物质。属于巨大质粒，其大小为200～800kb。Ri质粒和Ti 质粒不仅结构、特点相似，而且具有相同的寄主范围和相似的转化机理。与Ri质粒转化相关的也主要为Vir区和T-DNA区2部分。Ri质粒的T-DNA也存在冠瘿碱合成基因，且这些合成基因只能在被侵染的真核细胞中表达。根据其诱导的冠瘿碱的不同，Ri 质粒可分为3 种类型：农杆碱型(agropine)、甘露碱型(mannopine)和黄瓜碱型(cucumopine)。与Ti质粒的T-DNA不同的是，Ri质粒的T-DNA上的基因不影响植株再生。因此，野生型Ri质粒可以直接作转化载体。与Ti 质粒相同，Ri质粒基因转化载体的构建也主要采用有共整合载体和双元载体系统。由Ri 质粒诱发产生的不定根组织，经离体培养后，一般都可再生完整的植株。因此，利用Ri质粒作为转基因植物的载体，同样具有诱人的前景。3 病毒介导转化法病毒侵染细胞后把其DNA 导入寄主细胞，并且这些病毒DNA 能在寄主细胞中进行复制和表达。其本身就是一种潜在的基因转化系统。因此，病毒可以作为植物转基因的一种载体。随着植物病毒分子生物学及遗传学研究的不断深入，用病毒基因组作为载体转化植物细胞日益受到人们的重视。因为病毒载体能将外源基因导入植物的所有组织和细胞中，而且不受单子叶或双子叶的限制。在已知的300 多种植物病毒中，单链RNA 病毒约占91%左右，双链DNA 病毒、单链DNA病毒各占3%左右。RNA不太适合于作为克隆载体，因为RNA的操作非常困难。目前较为成熟的植物病毒载体是花椰菜花斑病毒(cauliflower mosaic virus, CaMV)和番茄金花叶病毒(tomato golden mosaic virus, TGMV)。（1）CaMV DNA载体转化法CaMV含有双链DNA基因组，将外源目的基因插入到CaMV DNA上，重组分子在体外包装成有感染力的病毒颗粒，就可高效转染植物原生质体，进而通过原生质体培养再生为整株植物。但CaMV 作为基因转化的载体也存在如下缺点，从而限制了其应用：①CaMV容纳外源DNA 的能力非常有限，即使是切除了非必须序列，也只能插入很小的片段；②CaMV 的寄主范围非常窄，主要是芸苔属(Brassica)植物如甘蓝和花椰菜等；③CaMV 是一种病原体，它的感染后会使寄主植物患病，降低产量和品质；④目前还没有发现有一种植物病毒DNA是可以整合到寄主染色体上的。这就不可能通过有性过程将插入的外源基因稳定地传递给感染植株的后代。⑤尽管CaMV DNA 可以感染植物，而带有外源基因的CaMVDNA 重组体则不能感染植物，这就必须通过原生质体予以克服。但通过原生质体再生植株对有些作物是非常困难的。并且植物病毒在植物组织中的传播也是受到限制的；⑥目前判断CaMV DNA感染的唯一的办法就是靠“症状”的表现，因此，对CaMV DNA载体来说，还需要一个更好的选择标记。
